DNA甲基化研究方法速递
DNA甲基化在维持细胞正常功能、传递基因组印记,胚胎发育、肿瘤发生等方面发挥重要作用,目前已经成为表观遗传学和表观基因组学的研究热点。针对不同的研究目的,基于高通量测序的甲基化研究方法也是日新月异,色彩缤纷,难免使人眼花缭乱,今日小编带你简要领略一下他们的不同之处。
DNA甲基化是一种被广泛研究的表观遗传修饰方式,与组蛋白修饰等方式一起,在调控基因表达和染色质构象等方面发挥了重要作用。通常地,甲基化DNA指5-甲基胞嘧啶(5mC),它是在DNA甲基转移酶(DNMT)的作用下将甲基基团添加到胞嘧啶的5’C位置上形成的。由于基因序列没有改变,常规的测序无法准确测出甲基化的相关信息,需要借助于特殊的方法。
WGBS(Whole Genome Bisulfite Sequence)全基因组甲基化测序,利用重亚硫酸氢盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶(C)脱氨基转变成尿嘧啶(U),而甲基化的胞嘧啶保持不变,然后通过PCR将U变为A,仅有甲基化的C可以成功保留,最后通过测序就可判断CpG位点是否发生甲基化。
特点:精确度高、重复性好,最大的特点是检测范围广,可以覆盖全基因组范围内的每一个C碱基的甲基化状态;但是该方法需要的数据量比较大,成本较高。
图1 全基因组甲基化建库流程图
scWGBS(single-cell whole genome bisulfite sequencing)单细胞全基因组甲基化测序,是基于单细胞水平的全基因组 DNA分析。scWGBS 先进行细胞的分选裂解并进行 BS 转化,然后使用 Oligo1(含有接头和9个随机序列)扩增5个循环(step 2),然后进行富集;用同样的方法引入另外一端的接头(step 3),然后进行 PCR 扩增,上机测序。
特点:能够精确解析单细胞中每一个胞嘧啶的甲基化状态。
图2 单细胞全基因组甲基化建库流程图
RRBS(Reduced Representation Bisulfite Sequencing),简化表观亚硫酸氢盐测序,是利用限制性内切酶对基因组进行酶切,大量提高CpG区域。酶切之后进行末端修复,连接接头,选择CpG富集的DNA片段用亚硫酸氢盐处理,然后进行PCR扩增。
特点:与全基因组甲基化测序相比,测序量大大减少。同时,利用RRBS可以实现多个样本的比对基因组分析;但是酶切位点有限,且酶切效率低均导致信息不全面。
图3 简化表观亚硫酸氢盐建库流程图
MeDIP(Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing) 甲基化 DNA 免疫共沉淀测序,先通过与5mC特异性结合的抗体加入到变性的基因组DNA片段中,富集胞嘧啶甲基化的基因组片断,然后对富集的片段进行高通量测序。
特点:检测范围覆盖全基因组,所需测序数据量较少,可广泛用于大样本量的疾病研究和分子育种研究;该方法仅能测定片段中的 DNA 甲基化情况,但是不能在单碱基分辨率水平上检测 DNA 胞嘧啶甲基化状态。使用抗体有非特异性结合的风险,最后得到的结果可能不是你想要的。
图4 甲基化DNA 免疫共沉淀测序建库流程图
RRHP(Reduced Representation 5-Hydroxymethylcytosine Profiling)DNA 羟甲基化,即 DNA 甲基化中的5-甲基胞嘧啶易发生氧化形成5-羟甲基胞嘧啶。Msp I 酶切完之后,末端修复,加上接头,然后 β-GT 反应将 5hmC 进行糖基化保护,无法被 Msp I 酶识别;然后进行再次酶切,与常规的 C 以及 5mC 相连的 P5 接头均被切下来,最后仅有含 5hmC 的片段含有两端接头,可以被扩增后建库测序。
特点:即可以检测基因组中的 5hmC 总量有可以测定特定序列中 5hmC 情况,但是仅限于酶切位点,应用有局限性。
图5 DNA羟甲基化建库流程图
oxBS-Seq(oxidativ ebisulfite sequencing)化学氧化结合重亚硫酸盐测序,在哺乳动物中,5mC 可以在TET酶的作用下转换成 5hmC,而传统的 WGBS 方法不能区分 5mC 和 5hmC。oxBS-Seq 技术先将 5hmC 氧化为甲酰基修饰(5fC),进而被重亚硫酸盐处理转换为U,从而排除了 5hmC 的干扰,实现 DNA 甲基化的精准检测。
特点:该方法为首个以单碱基分辨率对 5hmC 进行定量测序的方法,可以准确定位 5hmC 和 5mC 的位置,但是氧化反应的控制需要特别注意。
图6 化学氧化结合重亚硫酸盐流程图
以上就是常规的6种 DNA 甲基化研究方法,此外还有 MBD-seq、Target-BS 等等,不同的方法都有自己的适用性和局限性,期待更完善的研究方法应运而生!
参考文献
[1] Chromosome-wide and promoter-specific analyse sidentify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells. Nat. Genet. 2005.
[2] Quantitative Sequencing of 5-Methyl-cytosine and 5-Hydroxymethylcytosine at Single-Base Resolution. Sciencexpress, 2012.
[3] RRHP a tag-based approach for 5-hydroxymethylcytosine mapping at single-site resolution. Genome Biology, 2014.
[4] Single-cell genome-wide bisulfite sequencing for assessing epigenetic heterogeneity. Nature Methods, 2014.
建库测序业务线 何聪聪丨文案
王 迪丨编辑
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